當前專題
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酒精性脂肪肝模型飼料和復制模型方法

酒精性脂肪肝病模型是當前研究的熱點之一,使用的飼料種類不多,但是,使用中往往不容易達到預期,因此,務必的介紹中有詳細介紹。

常用的酒精性脂肪肝模型飼料
alert酒精性脂肪肝模型飼料大多采用Lieber-DeCarli酒精液體飼料,也有使用Tsukamoto-French酒精液體飼料和AIN93標準的酒精液體飼料。如果準備使用酒精液體飼料,務必閱讀下面的綜述,估計其中一定有你不知道但應當知道的信息。
文獻綜述
www.ytdsyjtsc.com
2012年7月1日出版

酒精性脂肪肝模型與飼料

(Model of nonalcoholic fatty liver disease,NASH,and model diet )
南通特洛菲飼料科技有限公司技術部 綜述

【摘要】酒精性脂肪肝模型的建立依賴酒精的攝入量。本文介紹了酒精性脂肪肝模型建立中為什么需用酒精液體飼料,詳細介紹了兩種飼料:Lieber-DeCarli酒精液體飼料和Tsukamoto-French酒精液體飼料。對這兩種模型飼料的優缺點進行了評價,對其中的Lieber-DeCarli酒精液體飼料用來建立酒精性脂肪肝模型所存在的問題、應對辦法和注意事項進行了詳細說明。至于AIN93酒精液體飼料,在相應網頁上已經做了詳細介紹,這里不再敘述。

【關鍵詞】酒精性脂肪肝;模型飼料;實驗動物

脂肪沉積在肝臟,稱為脂肪性肝。由飲酒(酒精)所致的脂肪肝稱為酒精性脂肪肝。關于另一種脂肪肝,那就是非酒精性脂肪肝(點擊查看非酒精性脂肪肝病模型與飼料)。 不少研究者簡單地認為,酒精性脂肪肝模型簡單,只要給予動物酒精就成。其實,關于酒精性脂肪肝的模型建立,有許多方面需要注意的,模型失敗或者不科學的情形并不少見。讓我們來看看怎樣建立酒精性脂肪肝。

一、酒精性脂肪肝造模需要注意

1. 為什么使用酒精液體飼料

有多種方法,包括酒精注射,灌胃,飲水中加入酒精,酒精液體飼料。

毫無疑問,酒精注射(血管或腹腔注射)的優點是想給多少動物就得到多少,血液酒精濃度高低容易控制,缺點是跨過了腸道的吸收過程,這種方法一般不使用于酒精性脂肪肝模型,多使用于酒精對機體的急性傷害性反應。

不少研究者首先想到的是采用灌胃法,這種方法能精確控制酒精攝入量,但缺點是,造成動物應激,并且實驗分組時需要加Sham組,尤其是,灌胃容易出錯:誤入氣管,因為酒精性脂肪肝模型建立需要比較長的時間,誤入氣管的機會多,影響機能狀態,甚至增大了死亡率。此外,由于不知道飼料中的成分和熱量情況,也就不知道動物獲得的酒精熱量占總熱量的百分比。更糟糕的是,灌胃法引起胃炎甚至胃潰瘍。

飲水中加入酒精,比較好地模仿了研究的行為,但缺點也很明顯,小型動物們不喜歡酒精,使得飲水減少,出現脫水現象,并由此影響飲食攝入,出現營養不良,而且血液中酒精濃度上不去。這在下面還會看這個問題。

那么,酒精液體飼料是怎么回事?所謂酒精液體飼料就是把飼料配制成液體狀態,在其中加入酒精。這種方法的優點是動物吃食物時酒精隨之攝入,酒精所占的熱量百分比是預先知道的,每天攝入多少食物,就可以知道攝入了多少酒精。但是,缺點也明顯,那就是,酒精影響食物攝入量。

在酒精性脂肪肝模型當中,最常采用的是酒精液體飼料法。有三種比較可取的酒精液體飼料,一種是Lieber-DeCarli酒精液體飼料,另一種是Tsukamoto-French 酒精液體飼料,還有一種是AIN93標準的酒精液體飼料,他們各有優缺點,接下來看看是怎么回事,怎樣使用。

2. 務必評估血漿酒精濃度

任何關于酒精致病的研究,都毫不例外地知道血漿酒精量,復制酒精性脂肪肝也不例外。有不少研究者把一切都寄托在飼料上,忽視對血液酒精的跟蹤。對酒精的跟蹤,能夠幫助評估模型建立的情況或者預測模型是否會失敗。例如,當發現酒精攝入量過少時,就可以估計脂肪肝形成或者脂肪沉積程度可能會不理想。

最理想的跟蹤酒精的方法當然是測定血液酒精的濃度。這在大動物是可取的,在小動物怎么辦呢,可以根據每天酒精液體飼料的食量和酒精在液體飼料中的濃度來推算酒精攝入量。比如,大鼠應當是每天大約每千克體重14-18毫克酒精,這就是比較滿意的酒精攝入量了。

二、關于Lieber-DeCarli酒精液體飼料

1. Lieber-DeCarli酒精液體飼料的由來

在上世紀中期,酒精模型的研究多采用飲水中加入酒精。但是這種方法中,動物厭惡酒精,因而飲水很少,產生脫水現象,這又導致攝食量減少,結果是動物狀態差,血液中酒精濃度也上不去。為了解決這些問題,DeCarli和Lieber在上世紀60年代首先采用了在液體飼料中加入酒精來喂養大鼠的方法。這就誕生了Lieber-DeCarli酒精液體飼料。后來得到廣泛使用,包括在各種動物中使用。現在,Lieber-DeCarli酒精液體飼料已經在原來的配方基礎上修飾出了多種液體酒精飼料,原先的配方飼料稱為regular型(也就是標準型)。

2. 標準型Lieber-DeCarli酒精液體飼料是怎么回事

標準型(regular型)Lieber-DeCarli酒精液體飼料,在總熱量中,酒精占36%,其他碳水化合物、蛋白質和脂肪的熱量分別是11%,18%和35%。也就是說,把酒精與飼料中的其他碳水化合物加起來,碳水化合物的熱量是47%,蛋白質仍然是18%,脂肪是35%。之所以這樣設計,是根據美國人群的營養推薦攝入量的比例。液體飼料每升提供1千卡的熱量,這是基于動物的熱量需要和食量來確定的。液體飼料中包含了大量的水,因此,喂養時可以不再額外給予飲水瓶給水了(理論上是這樣,實際上不是,下面有說明)。

這種液體飼料的設計,不僅適用于小型動物如大鼠、小鼠等,也適用于其他一些動物,比如,對于豬這樣的動物,對酒精并不厭惡,所以,喂養效果更好。

3. Lieber-DeCarli酒精液體飼料的對照飼料是怎么回事

對照飼料完全是按照美國推薦的人群營養素攝入量設計的,也就是,碳水化合物、蛋白質和脂肪分別提供的熱量是47%,18%和35%。

4. Lieber-DeCarli酒精液體飼料怎樣喂養

根據動物的飲用量,采用大小適當的動物飲水瓶,自由飲食。但是,一開始應當有7天的過渡期,從開始的酒精液體飼料占當天飲用量的1/3(另外2/3是對照液體飼料),過渡到2/3(另外1/3是酒精液體飼料),最后完全是酒精液體飼料。

5. 酒精性脂肪肝模型的情況

Lieber-DeCarli酒精液體飼料幾乎可以適用于實驗室任何常用動物來建立脂肪肝模型。

在大鼠中,根據液體飼料的攝入量換算成的酒精攝入量,大約是每公斤體重14-18克。建立酒精性脂肪肝模型大約需要4-6周。模型表現為脂肪肝,特點是肝臟全區均有脂肪沉積,在電鏡下可以看到肝細胞損傷。但是,肝纖維化很輕乃至不明顯,并不會發展到人體中出現的肝臟壞死、炎癥和肝硬化。如果用這樣的飼料喂養狒狒,幾年后發生肝硬化。

一般來說,大鼠中比較容易建立脂肪肝模型,而在小鼠并不容易取得滿意效果,最佳效果在8周左右,然后處于維持甚至減輕狀態。試圖延長喂養期來觀察纖維化甚至肝硬化,往往是徒勞的。

三、關于Lieber-DeCarli酒精液體飼料和對照液體飼料存在的問題及對付方法

很多研究者不僅不了解Lieber-DeCarli酒精液體飼料和對照液體飼料,而且想當然地覺得很簡單,最多也只是關注液體飼料怎樣喂,殊不知,很多人經歷了慘痛的失敗結局。下面,讓我們來看Lieber-DeCarli酒精液體飼料和對照液體飼料存在的問題,并且看看哪些是可以對付的,哪些是無法避免的。

1. Lieber-DeCarli酒精液體飼料存在的問題

大鼠和小鼠在飲用后血液中酒精的濃度比較低,主要原因是自由飲食,而這些動物厭惡酒精,飲用量不多,致使酒精攝入少,同時,熱量攝入也不足,更糟糕的是,飲用量小的情況下,動物脫水,動物飲食興趣(食欲)大幅度降低,動物變得消瘦、營養不良。因此,酒精攝入和飲食總熱量攝入都少的情況下,脂肪肝的形成受到影響,肝臟內病變也就很難發展。

所能夠解決的是防止脫水,辦法是:正常給水。也就是,除了用瓶子給酒精飼料,還應當按正常飼養的情況給飲水瓶。有些論文或者有的飼料公司說,動物從Lieber-DeCarli酒精液體飼料中得到的水能夠滿足動物的每日進水量,可以不再另外給水,這樣的說法是基于理論上的。給水不僅能夠防止脫水而影響模型效果,而且能夠避免可能影響的實驗分析指標,想必研究者都知道,血液處于濃縮狀態會影響血液指標。

有的研究者擔心,如果給水了,動物會不會吃液體飼料少了?其實,動物聰明的,不吃要挨餓。此外,適當補水還能夠避免食欲下降。

2. Lieber-DeCarli酒精液體飼料的對照液體飼料存在的問題

因為飼料組成是根據人類的營養素推薦攝入量來確定的,這本身就不符合像大鼠和小鼠等小型動物自身的要求,尤其是,脂肪的熱量達到總熱量的35%,對動物而言,這已經是高脂飼料。

因為對照飼料采用的脂肪,飽和過多,碳水化合物過少,可以出現非酒精性脂肪肝(NASH)。

正是因為如此,對照液體飼料喂養的動物,肝臟中也有脂肪沉積,也有炎癥,只是嚴重程度比酒精液體飼料輕。不可忽視的是,在酒精液體飼料組喂養8周之后,由于食量上不去,甚至減少,而對照液體飼料組在此時肝臟脂肪沉積和炎癥已經有所發展,往往出現兩組之間肝臟病理改變甚至肝功能指標都沒有差別,甚至對照液體飼料組比酒精液體飼料組更明顯。由此宣布模型失敗。

換句話說,Lieber-DeCarli酒精液體飼料的對照液體飼料對于小動物來說,是病態的飼料,不是正常飼料,很多問題都歸咎于此。

應對方法:

----不僅應當設立酒精液體飼料的對照液體飼料組,而且應當設立正常對照組(用符合AIN93標準或NRC95標準的液體飼料喂養)。

----保障酒精液體飼料組與液體飼料對照組相同的攝入量。方法在接下來介紹。

----需要喂養超過8周的實驗,應當把自由飲食給為強制喂養的方法,方法在接下來介紹。如果因為這樣做不能實現,可以在原先的自由飲食基礎上加輔助灌胃的辦法,但要注意灌胃的酒精量和灌胃頻率,畢竟是輔助,防止增大動物死亡率。

3. Lieber-DeCarli酒精液體飼料的飲食物量問題

小型動物厭惡酒精,但過渡期后也就適應了,但是,飲食量可能上不去,甚至會下來。這就可能因為食量與對照液體飼料組不同而影響實驗結果的可靠性。

對付的方法之一:應當考慮保持食量相同。也就是,錯開喂養:對照組今天的喂養量是昨天酒精液體飼料組的實際飲用量。

對付的方法之二:如果要求出現中度或中度以上的肝纖維化,或者要求出現肝壞死性炎癥、肝纖維化明顯的實驗模型,通過胃內埋管給予酒精液體飼料。

4. 小型動物和大型動物的差別

從研究報道來看,在大鼠、小鼠中使用Lieber-DeCarli酒精液體飼料復制的脂肪肝,很可能不是酒精引起的,而是營養不良所致,廣泛涉及很多營養素特別是維生素的缺乏。但是,在猿猴類上采用,可能是酒精所致,并且能夠模擬出人類的酒精性脂肪肝的演變過程以及向肝硬化發展的過程。

關于Lieber-DeCarli酒精液體飼料更為詳細的介紹,可以點擊查看Lieber-DeCarli酒精液體飼料和使用注意點

四、關于Tsukamoto-French 酒精液體飼料

1. Tsukamoto-French 酒精液體飼料的情況

Tsukamoto-French模型的酒精液體飼料中,酒精提供的熱量占47%,比上面介紹的Lieber-DeCarli酒精液體飼料中要高(36%)。這個模型是基于大鼠解酒(分解酒精)的能力比人要強,引起肝臟病變需要的血漿酒精濃度要高。

上面已經說過,像大鼠這一類的動物是討厭酒精的,把酒精濃度提高,勢必影響攝入量。為解決這個問題,使用Tsukamoto-French 酒精液體飼料時,應當采用胃內埋管給動物喂液體飼料,這就保障了酒精的攝入量,也就使得血中酒精濃度得以提升。可以使得大鼠血漿酒精濃度達到50-80mM(230-370mg/100毫升)。而Lieber-DeCarli液體飼料的模型動物中血液酒精的濃度只有20-40mM(90-180mg/100毫升.。

采用這種模型飼料和給飼料方法,大鼠在9周時肝小葉中心區壞死,炎癥,嚴重的脂肪肝,16周有早期纖維化(小膽管周圍),但沒有出現明顯的肝纖維增生或硬化表現。

2. Tsukamoto-French 酒精液體飼料使用情況

使用這種液體飼料時要考慮的是,飼料中使用比較多的不飽和脂肪酸和鐵含量,這加劇了肝臟損傷,這對于研究者來說要結合課題的具體情況來考慮是否選擇這種酒精液體飼料。當然,也是可以改進的,只要修改脂肪成分(不改變脂肪含量)和含鐵量即可。

這種液體飼料沒有得到廣泛使用的一個關鍵原因是,需要強制進食(胃管),很多研究者誤認為比較麻煩。其實,胃內埋管方法非常簡單,不像想象中的那樣難,關鍵是其中的技巧,請點擊閱讀“用于液體飼料的胃內埋管方法”。

關于Tsukamoto-French模型的酒精液體飼料的詳細介紹,可以點擊查看Tsukaoto-French模型酒精液體飼料和使用注意點

五、關于AIN93酒精液體飼料

AIN93本來就是大鼠和小鼠的標準飼料。在此基礎上設計的酒精液體飼料理應優先選擇使用。詳細情況請見AIN93酒精液體飼料和使用注意點




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