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當前專題

胎兒酒精暴露、胚胎酒精綜合征、胚胎酒精效應、
酒精性胚胎神經發育異常,等疾病的研究方法
FAE/FAS/FASD/ARND Procedure

胎兒酒精暴露(Fetal Alcohol Exposure, FAE)包括一系列胎兒疾病,最為典型的是胚胎酒精綜合征(Fetal Alcohol Syndrome,FAS)、胎兒酒精譜系障礙(Fetal Alcohol Spectrum Disorders,FASDs)、酒精性胚胎神經發育異常(Alcohol-Related Neurodevelopmental Disorder,ARND)。本網頁介紹在大鼠和小鼠中的研究方法,至于其他種類的動物基本相似。

一、大鼠、小鼠妊娠3期與人類妊娠3期的關系


大鼠、小鼠的妊娠與人類妊娠3期的對應關系是:

E1-E10:相當于人類妊娠早期(第1期,First trimeste);

E11-E20:相當于人類妊娠中期(第2期, Second trimester);

PND2-PND10:相當于人類妊娠后期(第3期,Third trimester)。

因此,如果研究妊娠三個時間(三個階段)中某個階段或某幾個階段的酒精暴露的效應(FAE),應當選擇對應時期。如果要研究宮內酒精暴露,則只能研究妊娠早期或妊娠中期,無法模擬人類的妊娠后期。

二、動物的準備和動物分組的要求


(1)選用處女鼠。小鼠一般不小于18g,大鼠一般可以選用70~85天齡。

(2)確保動物營養狀態正常。為此,應當采用符合動物營養需求的飼料進行預先喂養,讓動物在營養平衡的飼料喂養后進行妊娠。

關于動物分組:

除了喂養酒精液體飼料組和對照液體飼料之外,還應當設計一個標準飼料組。因此,如果研究中不可能酒精的劑量效應關系,至少需要這三組同時進行妊娠的實驗。

設計這個標準飼料喂養組的作用是:

由于妊娠或哺乳期間,酒精的作用包括對飼料攝入量(飲食攝入量)和酒精的作用兩方面。為了消除飼料攝入量的改變所致的效應,就需要將對照液體飼料組采用配對喂養法。由于酒精組攝入量一般是減少的,對照飼料組必然也就要強制減少攝入量,顯然,這個對照組營養狀況發生了改變,是否發生改變可以通過與標準飼料喂養組進行比較而得以回答。

換句話說,當3組進行比較時,酒精組的效應=酒精的效應+(標準組的效應-酒精對照組的效應)

三、飼料準備


(1)標準飼料:南通特洛菲飼料科技有限公司飼料代碼LAD3001G.

(2)酒精液體飼料和對照飼料

可以從南通特洛菲飼料科技有限公司購買以下模型飼料之一,點擊超鏈接可以了解其特點:

飼料代碼:TP4035:Lieber-DeCarli酒精液體飼料25%高蛋白型

飼料代碼:TP4040:Weinberg-Keiver酒精液體飼料

飼料代碼:TP4100:Yeh-Cerklewski酒精液體飼料

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飼料代碼:TP4045:Kahn酒精液體飼料

酒精液體飼料中酒精熱量(濃度):

應當根據研究需要和動物承受能力綜合決定。如果過高,動物難以承受,過低則可能效應不明顯。一般來說,小鼠可以在28%左右,大鼠可以稍高。

四、動物妊娠方法處理


(1)動物妊娠前用標準飼料喂養至少一周,平衡營養。

這一點非常重要,尤其是國內有些單位使用的飼料營養不合理,這種情況要特別注意進行預防性平衡營養。

(2)處女鼠出嫁(交配:mating):將處女鼠放入獨居的雄鼠籠內過夜。

(3)檢查精液栓(或精液涂片):次日早晨檢查精液栓。如何發現有精液栓,該天命名為E0(胚胎第0天,embryonic day 0),稱重,并將該母鼠標記為所在組別(用作哪一組)。

(4)根據選擇酒精暴露時期進行相應的喂養,采取過渡喂養逐漸增加酒精熱量。

四、妊娠早期(第1期)胚胎酒精暴露方法


妊娠早期是PND0-PND10(E0-E10)之間,應當根據研究需要選擇暴露的時間。E5-E7暴露酒精是文獻中最常采取的辦法,原因是E7為胚胎發育關鍵時期,E5開始讓胚胎開始暴露酒比較適合,如果過早,將可能導致妊娠終止或死胎。當然,取決于研究需要,如果希望在E0~E5之間開始,酒精熱量不宜過高和逐漸過渡特別重要。

過渡方法:以E0開始暴露酒精為例,

E0, 將1/3酒精液體飼料+2/3對照液體飼料混合后投料;

E1, 將1/2酒精液體飼料+1/2對照液體飼料混合后投料;

從E2開始,給予酒精液體飼料。

上述期間對照組給予對照液體飼料,配對喂養。標準組給予標準飼料,自由飲食。

在E10或E11時取胚胎和標本觀察,或繼續喂養,進行包括妊娠早期在內的兩期或三期酒精暴露試驗。

四、妊娠中期(第2期)胚胎酒精暴露方法


如果只研究中期妊娠,則采用標準飼料正常喂養到E10,E11開始喂酒精液體飼料:

E11, 將1/3酒精液體飼料+2/3對照液體飼料混合后投料;

E12, 將1/2酒精液體飼料+1/2對照液體飼料混合后投料;

從E3開始,給予酒精液體飼料。

上述期間,對照組給予對照液體飼料,配對喂養。標準組給予標準飼料,自由飲食。

E18開始逐漸減少酒精液體飼料。

E18, 將1/2酒精液體飼料+1/2對照液體飼料混合后投料;

E19, 將1/3酒精液體飼料+2/3對照液體飼料混合后投料;

E20開始,給予對照液體飼料;

從E19開始每天注意關注分娩(正常一般在E21分娩),一旦分娩,該天命名為PND0(postnatal day 0,出生當天),給予稱重,記錄出生數(雌性和雄性各多少)、存活數數和死亡數。

如果觀察腦的發育,可以在E13,E15,E18取出胎鼠觀察。

四、妊娠后期(第3期)胚胎酒精暴露方法


如果只研究妊娠后期,則采用標準飼料喂養到正常分娩(PND0),對幼鼠進行篩選和剔除。篩選的目的包括:

(1)體重、性別匹配;

(2)減少不同窩的幼鼠之間的生理機能的差異。為此,一般從不同窩中選擇相同數量的幼鼠。

從PND2開始對母鼠進行酒精液體飼料喂養,至PND10。

E2, 將1/2酒精液體飼料+1/2對照液體飼料混合后投料;

E3, 將1/3酒精液體飼料+2/3對照液體飼料混合后投料;

E4開始,給予對照液體飼料;

注意事項:

 (1)在PND0~PND6之間盡可能不要對幼鼠進行操作或減少操作,因為一旦取出放回后,母鼠會傷害幼鼠,影響幼鼠存活率。

(2)由于母鼠可能因為發生營養不良而“食仔”,應當密切觀察。為避免這種現象,可以從PND6開始在白天尤其是下午將母鼠和仔鼠分離。

(3)跟蹤幼鼠情況:體重改變情況,死亡情況,等等。

四、注意事項


在上面每一期每一天觀察:

(1)母鼠情況:體重改變情況,食物攝入量。

(2)上午7~8時尾靜脈取血分析血液酒精濃度。

其他注意事項,請繼續閱讀:妊娠期和哺乳期酒精效應的研究設計注意事項

References:

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Maier SE, West,JL. Patterns and Alcohol-Related Birth Defects(點擊后進入NIAAA網頁閱讀)



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